一种扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法

点击数:23382013-05-05 01:17:36 来源: 四川农业大学 动物科技学院

 

发明名称:一种扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法

本发明涉及一种扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法,属于农业栽培中通过组织培养技术的植物再生领域。

背景技术:

扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa (Linn. f.) R. Br)是禾本科牛鞭草属多年生草本植物,茎细软,饲草品质好,牲畜喜食,既可放牧利用,也可晒制干草。此外,牛鞭草根系发达,草丛厚密,覆盖面大,也是良好的水土保持植物。扁穗牛鞭草的种植既可以满足生态环境建设的需要,更是促进畜牧业可持续发展的重要措施。

发表在《中国草地学报》(2007,29(2):50~53)的“扁穗牛鞭草组织培养体系建立”一文公开了扁穗牛鞭草组织培养技术,该技术以扁穗牛鞭草茎段为外植体,选用初代培养最佳配方为MS培养基+6-BAl.5mg/L+NAA0.2mg/L,再生苗的继代增殖培养基配方为MS培养基+6-BA1.5mg/L+NAA0.2/L,生根培养基配方为1/2MS培养基+BA0.2mg/L。该文献公开的操作流程第一步进行启动培养得到愈伤组织,第二步即对再生苗的继代增殖培养,两步骤之间缺少了对从愈伤组织得到再生苗培养过程的必要描述,因此所公开的技术方案并不完整。并且该文献公开的扁穗牛鞭草组织培养技术并不能重复再现,第一步启动培养阶段诱导愈伤组织的操作便存在技术困难,无法有效完成后继操作。

发明内容:

本发明的目的就是针对现有技术的不足,提供一种扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法,该方法重复性好、再生率高。为实现上述目的,本发明的技术方案如下:

一种扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法,按照步骤S1愈伤组织诱导、步骤S2愈伤组织继代培养、步骤S3愈伤组织分化培养、步骤S4再生苗增殖培养、步骤S5再生苗生根培养、步骤S6再生苗炼苗移栽的操作流程进行;在步骤S1愈伤组织诱导中使用启动培养基,在步骤S2愈伤组织继代培养中使用继代培养基,在步骤S3愈伤组织分化培养中使用愈伤组织分化培养基,在步骤S4再生苗增殖培养中使用再生苗增殖培养基,在步骤S5再生苗生根培养中使用生根培养基;其特征在于:以扁穗牛鞭草的幼茎或幼叶为外植体。

植物的高频再生体系是以植物组织培养技术为主要手段,在整个体系上既需要保证再生体系的各阶段培养能够完整实施,又需要体现出再生苗数量与增殖系数的优势。要达到这样的技术效果,主要的技术手段一是选择恰当植物外植体材料,二是对各阶段培养基组分的选择与优化。

本技术方案选择扁穗牛鞭草的幼茎或幼叶为外植体,消毒后在无菌环境下接种到组分为MS培养基+2,4-D的启动培养基上进行愈伤组织诱导培养;培养得到的愈伤组织经继代培养后转入组分为MS培养基+6-BA +NAA的愈伤组织分化培养基中进行分化培养;分化培养得到的再生苗经增殖培养后转入组分为1/2MS+NAA培养基的生根培养基中进行再生苗生根培养,得到的幼苗最终炼苗、移栽。

在优选条件下,上述方法可以选择扁穗牛鞭草的幼叶为外植体。所建立的扁穗牛鞭草高频再生体系具有更良好的技术效果。

在优选条件下,上述方法可以通过对各培养阶段中培养基组分的优化提高扁穗牛鞭草高频再生体系在各阶段的产出率与产物品质。

与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明提供的扁穗牛鞭草高频再生体系建立方法具有生长繁殖快、重复性高、操作简单、条件易于控制等特点。特别是通过本发明方法能获得外表干燥、致密、乳白色的扁穗牛鞭草胚性愈伤组织,其中的颗粒状胚性愈伤组织也适用于体细胞突变体的筛选和农杆菌介导法的基因转化,能够为扁穗牛鞭草开辟新的育种途径提供条件。

操作:

实施例一

1、材料

(1)植物外植体材料:以扁穗牛鞭草的幼叶为外植体材料。

(2)主要试剂:

2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)母液:2,4-D用少量无水乙醇溶解后,加蒸馏水配成1mg/L的母液,于4℃下保存待用。

6-BA(6-苄基氨基嘌呤)母液:6-BA用少量10%氢氧化钠溶解后,加蒸馏水配成1mg/L的母液,于4℃下保存待用。

NAA(萘乙酸)母液:NAA用少量10%氢氧化钠溶解后,加蒸馏水配成1mg/L的母液,于4℃下保存待用。

(3)基础培养基:MS培养基,MS培养基在高压灭菌前调整pH至5.8。

2、操作步骤

(1)步骤S1愈伤组织诱导

启动培养基:MS培养基+2,4-D 0.5~2.5mg/L

将外植体材料置于75%的酒精中灭菌30s,取出后用无菌水冲洗3次,再浸于0.1%的氯化汞中灭菌约8min,取出后用无菌水冲洗4~6次;在无菌环境下,将外植体材料接种到启动培养基上进行愈伤组织诱导培养。培养条件为23±2℃,黑暗培养,每隔15 d更换一次培养基。愈伤组织诱导培养60d,培养结果如表1所示。

表1 愈伤组织诱导结果

培养基成分

培养结果

基础培养基

2,4-D(mg/L)

出愈率(%)

愈伤组织的状态

MS培养基

0.5

70.00

暗白色,颗粒状,有少许不定根

MS培养基

0.6

75.32

乳白色,颗粒状

MS培养基

1.0

100.00

乳白色,颗粒状

MS培养基

1.4

79.47

乳白色,颗粒状

MS培养基

2.5

50.00

乳白色,颗粒状

(2)步骤S2愈伤组织继代培养

继代培养基:MS培养基+2,4-D1.0mg/L

将步骤S1中得到的愈伤组织转接入筛选出的继代培养基中进行愈伤组织继代培养。继代培养基的筛选依照组织培养常规操作方法进行。愈伤组织继代培养每隔15d更换一次培养基,培养60d,培养结果如表2所示。

表2 愈伤组织继代培养结果

培养基成分

培养结果

基础培养基

2,4-D(mg/L)

出愈率(%)

愈伤组织状态

MS培养基

1.0

3 7.5

表面干燥,乳白色,颗粒状

(3)步骤S3愈伤组织分化培养

愈伤组织分化培养基:MS培养基+6-BA 0.5~2.0mg/L+NAA 0.1~0.3 mg/L

将步骤S2得到的生长质量良好的愈伤组织转入愈伤组织分化培养基中进行分化培养。培养条件为25±2℃、2000~3000lx 、16hr/d。愈伤组织分化培养每隔10d更换一次培养基,培养30d,培养结果如表3所示。

表3 愈伤组织分化培养结果

培养基成分

分化率(%)

基础培养基

6-BA(mg/L)

NAA(mg/L)

MS培养基

0.5

0.1

13.18

MS培养基

0.5

0.3

17.5

MS培养基

0.6

0.1

15.71

MS培养基

0.6

0.3

18.34

MS培养基

1.0 

0.1

57.14

MS培养基

1.0 

0.2 

100.00

MS培养基

1.0 

0.3

38.57

MS培养基

1.4

0.2

67.42

MS培养基

2.0

0.2

27.78

MS培养基

2.0

0.3

0

(4)步骤S4再生苗增殖培养

再生苗增殖培养基:MS培养基+6-BA 0.5~2.0mg/L+NAA 0.1~0.3 mg/L。

将经步骤S3培养得到的再生苗中长有3片完整叶片的再生苗转入再生苗增殖培养基中进行再生苗增殖培养。培养条件为23±2℃、10001500~152000lx、12 hr/d;。再生苗增殖培养每隔10d更换一次培养基,培养60d,培养结果如表4所示。

表4 再生苗增殖培养结果

培养基成分

增殖培养结果

基础培养基

6-BA(mg/L)

NAA(mg/L)

增殖系数

增殖苗生长状况

MS培养基

0.5

0.1

1.1

+

MS培养基

0.5

0.3

1.2

+

MS培养基

0.6

0.1

2.5

+

MS培养基

0.6

0.3

2.8

+

MS培养基

1.0 

0.1

4.2

++

MS培养基

1.0 

0.2 

18.6

+++

MS培养基

1.0 

0.3

3.5

++

MS培养基

1.4

0.2

7.4

+++

MS培养基

2.0

0.2

2.5

+

MS培养基

2.0

0.3

1.0

+

注:①增殖系数=出芽数/接种株数;②“+”植株生长细弱,叶片细小、黄化,增殖系数低;③“++”植株生长势较弱,叶片浅绿色,增殖系数较低;④“+++”植株生长健壮,簇生,叶片深绿色,增殖系数高。

(5)步骤S5再生苗生根培养

生根培养基:1/2MS培养基+ NAA0~1.0mg/L

将步骤S4得到的生长状况良好的再生苗转入再生苗生根培养基中进行再生苗的生根培养。培养条件为28±2℃、2000~3000lx、16hr/d。生根培养30d,生根培养结果如表5所示。

表5 再生苗生根培养结果

培养基成分

生根率(%)

基础培养基

NAA(mg/L)

1/2MS培养基

0

100

1/2MS培养基

0.4

48

1/2MS培养基

1.0

20

(6)步骤S6再生苗炼苗移栽

将生长20~30d的幼苗进行炼苗,具体为:首先将培养瓶移出培养室,在室温下炼苗2~3d,揭开封口膜,加入自来水,以淹没过培养基为宜,继续炼苗3d。把经过炼苗的幼苗基部的残留琼脂小心洗净,注意不伤到幼苗根部,洗净后移栽至小盆内,移栽基质为沙土。

实施例二

用本发明方法建立扁穗牛鞭草高频再生体系,其与实施例一相同之处不再重复,其不同之处在于:

(1)步骤S1愈伤组织诱导

启动培养基:MS培养基+2,4-D 0.5~2.5mg/L+6-BA 0~1.0mg/L

愈伤组织诱导培养60d,培养结果如表6所示。

表6 愈伤组织诱导结果

培养基成分

培养结果

基础培养基

2,4-D(mg/L)

6-BA(mg/L)

出愈率(%)

愈伤组织的状态

MS培养基

0.5

<0.1

44.98~100.00

乳白色,颗粒状

MS培养基

0.6

MS培养基

1.0

MS培养基

1.4

MS培养基

2.5

MS培养基

0.5

0.1~0.4

34.28~77.34

暗白色,水渍状

MS培养基

0.6

MS培养基

1.0

MS培养基

1.4

MS培养基

2.5

MS培养基

0.5

0.4~1.0

11.03~47.36

浅褐色,粘稠状

MS培养基

0.6

MS培养基

1.0

MS培养基

1.4

MS培养基

2.5